Blutproben

Blutausstriche vorbereiten

Wenn Sie venöses Blut verwenden, sollten Blutausstriche so bald wie möglich nach der Entnahme hergestellt werden (eine Verzögerung kann zu Änderungen der Parasitenmorphologie und der Färbungseigenschaften führen).

Dicke Abstriche

Dicke Abstriche bestehen aus einer dicken Schicht dehämoglobinisierter (lysierter) roter Blutkörperchen (RBCs). Die Blutelemente (einschließlich etwaiger Parasiten) sind konzentrierter (ca. 30 ×) als in einem gleichen Bereich eines dünnen Abstrichs. Dicke Abstriche ermöglichen somit einen effizienteren Nachweis von Parasiten (erhöhte Empfindlichkeit). Sie erlauben jedoch keine optimale Überprüfung der Parasitenmorphologie. Zum Beispiel sind sie oft nicht ausreichend für die Artenidentifikation von Malariaparasiten: Wenn der dicke Abstrich positiv für Malariaparasiten ist, sollte der dünne Abstrich zur Artenidentifikation verwendet werden.

Bereiten Sie mindestens 2 Abstriche pro Patient vor!

  1. Geben Sie einen kleinen Tropfen Blut in die Mitte des vorgereinigten, beschrifteten Objektträgers.
  2. Verteilen Sie den Tropfen mit der Ecke eines anderen Objektträgers oder eines Applikatorstifts in einem kreisförmigen Muster, bis er die Größe eines Cent (1,5 cm2) hat.
  3. Ein dicker Abstrich mit der richtigen Dichte ist einer, der, wenn er über Zeitungspapier gelegt (nass) wird, es Ihnen ermöglicht, die Wörter kaum zu lesen.
  4. Legen Sie die Objektträger flach und lassen Sie die Abstriche gründlich trocknen (vor Staub und Insekten schützen!). Unzureichend getrocknete Abstriche (und / oder zu dicke Abstriche) können sich während des Färbens von den Objektträgern lösen. Das Risiko ist bei Abstrichen mit gerinnungshemmendem Blut erhöht. Bei Raumtemperatur kann das Trocknen mehrere Stunden dauern; 30 Minuten sind das Minimum; Im letzteren Fall den Abstrich beim Färben sehr vorsichtig behandeln. Sie können das Trocknen mit einem Ventilator oder einem Haartrockner beschleunigen (kühle Einstellung verwenden). Schützen Sie dicke Abstriche vor heißen Umgebungen, um zu verhindern, dass der Abstrich durch Hitze fixiert wird.
  5. Fixieren Sie keine dicken Abstriche mit Methanol oder Hitze. Wenn sich die Färbung der Abstriche verzögert, tauchen Sie den dicken Abstrich kurz in Wasser, um die Erythrozyten zu hämolysieren.
Kratzmethode für dicke Abstriche

Die Kratzmethode ist eine alternative Methode zur Herstellung von dicken Filmen, die eine verbesserte Haftung und schnellere Durchlaufzeiten ermöglicht. Das Verfahren ähnelt der Herstellung eines normalen dicken Films, aber anstatt einen Stift zum Verteilen des Blutes zu verwenden, wird die Kante eines Glasmikroskop-Objektträgers verwendet, während fester Druck ausgeübt wird, um kleine Kratzer im darunter liegenden Objektträger zu erzeugen.Die Kratzer ermöglichen eine verbesserte Haftung des Blutfilms auf dem Objektträger, ohne die Abstrichmorphologie zu beeinflussen. Der Abstrich kann dann gefärbt werden, sobald er trocken ist, im Allgemeinen innerhalb von 20 bis 30 Minuten nach der Vorbereitung des Abstrichs.

Referenz: Norgan AP, Arguello HE, Sloan LM, Fernholz EC, Pritt BS. Malaria Journal 2013; 12: 231.

Dünne Abstriche

Dünne Abstriche bestehen aus Blut, das in einer Schicht so verteilt ist, dass die Dicke zum gefiederten Rand hin zunehmend abnimmt. In der gefiederten Kante sollten sich die Zellen in einer Monoschicht befinden und sich nicht berühren.

Bereiten Sie mindestens 2 Abstriche pro Patient vor!



Ein dünner Abstrich wird vorbereitet.

  1. Geben Sie einen kleinen Tropfen Blut auf den vorgereinigten, etikettierten Objektträger in der Nähe seines mattierten Endes.
  2. Bringen Sie einen weiteren Objektträger in einem Winkel von 30-45 ° zum Tropfen, damit sich der Tropfen entlang der Kontaktlinie der beiden Objektträger ausbreiten kann.
  3. Schieben Sie den oberen (Spreiz-) Schlitten schnell in Richtung des nicht gefrorenen Endes des unteren Schlittens.
  4. Stellen Sie sicher, dass die Abstriche eine gute gefiederte Kante haben. Dies wird durch die Verwendung der richtigen Blutmenge und die richtige Ausbreitungstechnik erreicht.
  5. Lassen Sie die dünnen Abstriche trocknen. (Sie trocknen viel schneller als die dicken Abstriche und sind weniger ablösbar, da sie fixiert werden.)
  6. Fixieren Sie die Abstriche, indem Sie sie in absolutes Methanol tauchen.

Hinweis: Unter Feldbedingungen, bei denen die Objektträger knapp sind, bereiten nationale Malariaprogramme (und CDC-Mitarbeiter) sowohl einen dicken als auch einen dünnen Abstrich auf demselben Objektträger vor. Dies funktioniert ausreichend, wenn sichergestellt wird, dass von den beiden Abstrichen nur der dünne Abstrich fixiert ist.

Spezielle Verfahren zum Nachweis von Mikrofilarien

Blutmikrofilarien:

  1. Kapillarblut (Fingerstick)
    Da sich Mikrofilarien in den peripheren Kapillaren konzentrieren, werden dicke und dünne Abstriche aus Fingerstickblut empfohlen.
  2. Antikoaguliertes (EDTA) venöses Blut (1 ml) sollte nach einer der folgenden Methoden konzentriert werden:
    1. Zentrifugation (Knott-Technik)
      1. Bereiten Sie 2% Formaldehyd vor (2 ml 37% Formaldehyd + 98 ml H2O).
      2. Mischen Sie 9 ml dieses 2% igen Formaldehyds mit 1 ml venösem Blut des Patienten. 500 × zentrifugieren G für 10 Minuten; Überstand verwerfen. Das Sediment besteht aus WBCs und Mikrofilarien (falls vorhanden).
      3. Untersuchen Sie als temporäre nasse Reittiere.
      4. Bereiten Sie dicke und dünne Abstriche vor. Trocknen lassen; Tauchen Sie vor der Giemsa-Färbung in absolutes Methanol, um die Färbung der Mikrofilarien zu verbessern.
    2. Filtration
      1. Setzen Sie den Millipore®- oder Nucleopore®-Membranfilter (5 µm Pore) in den Filterhalter mit Spritzenaufsatz.
      2. Mischen Sie 1 ml venöses Blut (in EDTA) mit 10 ml 10% Teepol® 610 (Shell Co.); einige Minuten stehen lassen, um die Lyse zu ermöglichen; in eine 10 ml Luer-Loc®-Spritze überführen; Befestigen Sie die Filtervorrichtung.
      3. Drücken Sie die Lösung durch den 5-µm-Porenfilter, gefolgt von mehreren Spritzen Wasser, um das verbleibende Blut auszuwaschen, und dann 1 oder 2 Spritzen mit Luft, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
      4. Bereiten Sie eine vorübergehende nasse Halterung vor, indem Sie den Filter entfernen und auf einen Objektträger legen, indem Sie einen Tropfen Fleck oder Farbstoff und ein Deckglas hinzufügen.
      5. Führen Sie für dauerhafte Zubereitungen 2 bis 3 ml Methanol durch den Filter, während es sich noch im Halter befindet. Entfernen Sie den Filter und trocknen Sie ihn auf einem Objektträger. Färben Sie es dann horizontal mit Giemsa-Färbung (damit der Filter den Objektträger nicht abwäscht). Deckglasfilter vor der Untersuchung.

Weitere Informationen zur Herstellung von Blutausstrichen erhalten Sie von der Abteilung für parasitäre Krankheiten unter (404) 718-4110.

Referenz:

Eberhard ML, Lammie PJ. Labordiagnose der Filariose. Clin Lab Med 1991; 11: 4.

DPDx ist eine Bildungsressource für Angehörige der Gesundheitsberufe und Laborwissenschaftler. Eine Übersicht einschließlich Prävention, Kontrolle und Behandlung finden Sie unter www.cdc.gov/parasites/.