Verfahrenshandbuch für Legionärskrankheiten zur Genesung

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Dieses Handbuch beschreibt die Verfahren, die derzeit von den Zentren für die Kontrolle und Prävention von Krankheiten angewendet werden, um Umweltproben zu verarbeiten, die bei Untersuchungen von Legionellose-Ausbrüchen entnommen wurden. Es enthält Informationen über die Entnahme und Konzentration von Wasserproben, die Vorbereitung von Proben für die bakteriologische Untersuchung, Formeln für Medien und Quellen für Reagenzien.

Nationales Zentrum für Immunisierung und Atemwegserkrankungen
Abteilung für bakterielle Krankheiten
Zweig Atemwegserkrankungen
Labor für Lungenentzündung und Überwachung
Januar 2005

US-Gesundheitsministerium
Zentren für die Kontrolle und Prävention von Krankheiten
Atlanta, GA 30329

Einführung

Krankheit durch die gramnegativen Bakterien der Gattung Legionellen wird als Legionellose bezeichnet. Legionellose besteht aus zwei unterschiedlichen klinischen Syndromen, der Legionärskrankheit und dem Pontiac-Fieber. Die Legionärskrankheit ist durch eine Lungenentzündung gekennzeichnet, bei der das Pontiac-Fieber eine selbstlimitierende, nicht pneumonische, grippeähnliche Krankheit ist. Es wird angenommen, dass das Einatmen von Aerosolen, die das Bakterium enthalten, das primäre Mittel zum Erwerb von Legionellose ist. Aerosolisiertes Wasser aus Kühltürmen, Verdunstungskondensatoren, Duschen und Luftbefeuchtern wurde als Infektionsquelle identifiziert. Legionellen Arten wurden aus einer Vielzahl von häuslichen Wassersystemen gewonnen und sind in Süßwasserumgebungen allgegenwärtig. Obwohl Legionellen früher als vorübergehende Kontaminanten natürlicher und häuslicher Gewässer angesehen wurden, sind sie heute als frei lebende Organismen bekannt, die als natürliche Bestandteile von Süßwasserökosystemen überleben. Inländische Systeme sind komplexe Umgebungen, in denen die Legionellenkonzentrationen in Abhängigkeit von der Wassertemperatur, den Biozidwerten und dem Vorhandensein natürlicher Wirte (d. H. Protozoen), in denen Legionellen parasitieren können, erheblich schwanken können. Die Wahl des Verfahrens zur Gewinnung von Legionellen aus Wasserproben hängt vom erwarteten Grad der bakteriellen Kontamination in einer bestimmten Wasserquelle ab. Trinkwasser hat im Allgemeinen eine geringe Bakteriendichte und wird entweder direkt kultiviert oder konzentriert, um Legionellen nachzuweisen. Nicht trinkbares Wasser, wie das von Kühltürmen, erfordert aufgrund ihrer hohen Bakterienkonzentration im Allgemeinen keine Konzentration.

Dieses Handbuch beschreibt die Verfahren, die derzeit von den Zentren für die Kontrolle und Prävention von Krankheiten angewendet werden, um Umweltproben zu verarbeiten, die bei Untersuchungen von Legionellose-Ausbrüchen entnommen wurden. Es enthält Informationen über die Entnahme und Konzentration von Wasserproben, die Vorbereitung von Proben für die bakteriologische Untersuchung, Formeln für Medien, Reagenzienquellen und Luftprobenentnahmetechniken.

Sammlung von Exemplaren

Ein Umweltprobenahmeprotokoll zur Auswahl der geeigneten Probenahmestellen wurde bereits veröffentlicht (Barbaree et al., 1987). Wann immer möglich, wird eine Sammlung von 1 (einem) Liter Wasser bevorzugt. Gelegentlich werden größere Wassermengen (1 bis 10 Liter) benötigt, um Legionellen in Wasser mit sehr geringen Konzentrationen dieser Bakterien wie der kommunalen Wasserversorgung nachzuweisen. Wenn ein Liter nicht aus einer Probenquelle entnommen werden kann, ist ein kleineres Volumen akzeptabel. Wasserproben sollten in einer sterilen 1-Liter-Weithals-Polypropylen-Plastikflasche mit Schraubverschluss gesammelt werden. Wenn die Wasserquelle kürzlich mit Chlor behandelt wurde, geben Sie 0,5 ml 0,1 N Natriumthiosulfat zu jeder 1-Liter-Probe, um das Desinfektionsmittel zu neutralisieren.

Abstriche von Wasserhahnbelüftern und Duschköpfen sollten vor Wasserproben von diesen Stellen entnommen werden. Die Probe sollte nach Möglichkeit mit entferntem Belüfter oder Duschkopf entnommen werden. Polyestertupfer mit Holzschäften eignen sich gut für diesen Zweck. Die Tupfer sollten in 3-5 ml gleichzeitig eingetauchtes Wasser getaucht werden, um ein Austrocknen während des Transports zu verhindern.

Alle Proben sollten zum Schutz vor extremer Hitze oder Kälte in isolierten Kühlern ins Labor transportiert werden. Proben, die nicht innerhalb von 72 Stunden das Labor erreichen, sollten vor dem Versand gekühlt werden. Proben, die das Labor erreichen, aber nicht innerhalb von 72 Stunden nach der Entnahme verarbeitet werden können, sollten gekühlt werden.

Vorbereitung der Proben für die bakteriologische Untersuchung

a) Filtration (Trinkwasser)

Die Proben werden filterkonzentriert, indem die Proben in eine sterile 47-mm-Filtertrichteranordnung gegossen werden, die einen 0,2 um Polycarbonatfilter enthält (Fisher Scientific, 3970 Johns Creek Ct., Suite 500, Suwanee, GA 30024). Für den Betrieb des Geräts sind eine Vakuumquelle und ein Seitenarmkolben erforderlich (Abbildung 1). Es ist darauf zu achten, dass die Filter nicht austrocknen. Wenn die Probe den Filter passiert hat, wird der Filter mit einer sterilen Filterzange aseptisch aus dem Halter entfernt, nach außen gefaltet und in ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit 5 ml sterilem Wasser gegeben. Das Zentrifugenröhrchen wird dann eine Minute lang verwirbelt, um Bakterien und organisches Material vom Filter zu befreien. Wenn mehr als ein Filter erforderlich ist, um eine Probe zu konzentrieren, werden die zusätzlichen Filter in dasselbe Probenröhrchen gegeben.

b) Direktbeschichtung (nicht trinkbares Wasser)

Nicht trinkbares Wasser erfordert selten Konzentration und kann direkt verarbeitet werden. Proben, bei denen beim direkten Plattieren hohe Bakterienkonzentrationen festgestellt wurden, können mit einem Puffer mit niedrigem pH-Wert behandelt oder seriell mit sterilem entionisiertem Wasser, einem geeigneten Puffer oder sterilem chorinfreiem Leitungswasser verdünnt werden, um die primäre Isolierung von Legionellen zu verbessern.

Beschichtung von Proben

Gepufferter Agar-Extrakt aus Holzkohlehefe (BCYE), der 0,1% Alpha-Ketoglutarat enthält, ist das Basismedium, das zur Gewinnung von verwendet wird Legionellen aus Umwelt- und klinischen Proben (Anhang 1). Zwei Arten von selektivem BCYE-Agar, die mit antimikrobiellen Mitteln ergänzt sind, sind im Standardschema der Medien enthalten, die bei der Verarbeitung von Umweltproben verwendet werden. Das erste, als PCV bezeichnete, enthält Polymyxin B, Cycloheximid und Vancomycin. Das zweite, GPCV, ist bis auf die Zugabe der Aminosäure Glycin zum Medium mit PCV identisch. PCV ohne L-Cystein [PCV (-)] kann als negatives Kontrollmedium verwendet werden. Verschiedene Variationen der antimikrobiellen Ergänzungsmittel wurden beschrieben und scheinen für die Wiederherstellung von Legionellen angemessen zu sein. 2 zeigt eine Wasserprobe, die auf den vier oben beschriebenen Medien kultiviert wurde.

Obwohl die Mehrheit von Legionellen spp. wachsen leicht auf BCYE, einige erfordern eine Ergänzung mit Rinderserumalbumin, um das Wachstum zu fördern. Legionella micdadei und mehrere Stämme von Legionellen bozemanii zeigen eine Präferenz für BCYE mit 1,0% Albumin (ABCYE) gegenüber Standard-BCYE. Die Aufnahme von ABCYE in das Schema der Plattierungsmedien kann vorteilhaft sein, wenn klinische Beweise darauf hinweisen, dass eine andere Art als Legionellen Pneumophila kann der Erreger sein.

Beschichtung von gefilterten Proben

  1. Nach dem Verwirbeln des Filters (siehe Vorbereitung der Proben) 1 BCYE-, 2 PCV- und 2 GPCV- und 1 PCV (-) Platte mit jeweils 0,1 ml der Suspension beimpfen und mit einem sterilen Glas oder einem sterilen Einweg-Kunststoffstab verteilen.
  2. Inkubieren Sie die Platten bei 35 ° C in einem Kerzenglas oder in einem angefeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 2,5% CO2 in Luft.
  3. Lagern Sie den Rest der Probe bei 4 ° C.

Direkte Beschichtung

  1. Geben Sie 0,1 ml der Probe wie oben beschrieben auf BCYE- und modifizierte BCYE-Platten und verteilen Sie sie mit einem sterilen Glasstab oder einem sterilen Einweg-Kunststoffverteiler.
  2. Platten wie oben beschrieben inkubieren.

Säurebehandlung

Bei einigen Wasserproben mit hohen Bakterienkonzentrationen ist ein selektives Verfahren erforderlich, um die Anzahl der Nicht-Bakterien zu verringern.Legionellen Bakterien vor der Kultur. Zu diesem Zweck werden routinemäßig Säurebehandlung und Erhitzen von Proben verwendet. Legionellen sind resistenter gegen einen niedrigeren pH-Wert und kurzzeitig höheren Temperaturen ausgesetzt als viele andere Süßwasserbakterien. Das folgende Verfahren wird von CDC-Laboratorien verwendet, um diese Proben für die Kultur vorzubereiten.

  1. 1,0 ml der verwirbelten Suspension in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 1,0 ml Säurepuffer geben und mischen (Anhang 2).
  2. Die angesäuerte Suspension 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. (Die Säurebehandlung kann auf 30 Minuten verlängert werden, wenn die Platten nach der ersten 15-minütigen Behandlung überwachsen sind.)
  3. 0,1 ml der Suspension auf BCYE- und modifizierte BCYE-Platten geben und mit einem sterilen Glasstab oder einem sterilen Einweg-Kunststoffverteiler verteilen.
  4. Inkubieren Sie die Platten bei 35 ° C in einem Kerzenglas oder in einem angefeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 2,5% CO2 in Luft.

Abbildung 2. Eine Wasserprobe mit Legionellen nach der Kultur auf den vier Medientypen. Platte 1, BCYE-Agar mit zahlreichen Nicht-Legionellen Bakterien und einige Legionellen Kolonien; Platte 2, PCV-Agar mit zahlreichen Legionellen Kolonien und andere Bakterien; Platte 3, GPCV-Agar mit Legionellen, wenige, wenn überhaupt nichtLegionellen Bakterien sind vorhanden; Platte 4, PCV-ohne Cysteinagar mit etwas Nicht-Legionellen Bakterien; Es sind keine Legionellen vorhanden.

Untersuchung von Kulturen auf Legionellen

  1. Untersuchen Sie alle Kulturen nach 72 bis 96 Stunden Inkubation. Die makroskopische Untersuchung sollte mit einem Seziermikroskop und schrägem Licht durchgeführt werden, um ähnliche Bakterienkolonien zu erkennen Legionellen. Diese Kolonien sind konvex und rund mit ganzen Kanten (Abbildung 3). Das Zentrum der Kolonie hat normalerweise eine hellweiße Farbe mit einem strukturierten Erscheinungsbild, das als „schnittglasartig“ oder gesprenkelt beschrieben wurde. Das weiße Zentrum der Kolonie ist häufig von blauer, violetter, grüner oder roter Autofluoreszenz begrenzt. Eine weitere Untersuchung der primären Isolationsplatten mit langwelligem UV-Licht kann diese fluoreszierenden Kolonien leicht nachweisen.
  2. Nehmen Sie jede verdächtige Kolonie aseptisch auf (a) BCYE-Agarplatte ohne L-Cystein [BCYE (-)] oder eine BCYE / BCYE (-) - Doppelplatte. Wenn eine L-Cystein (-) - Doppelplatte nicht verfügbar ist, ist eine andere wünschenswerte Alternative ein anderes L-Cysteinmedium wie eine Blutagarplatte. Wählen Sie 2-4 repräsentative Kolonien pro Wasserprobe
  3. Streifen Sie den beimpften Teil jeder Platte mit einer sterilen Schleife ab, um Bereiche mit starkem Wachstum bereitzustellen, und inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang.
  4. Wenn nach 24 Stunden kein Wachstum festgestellt wird, setzen Sie die Inkubation für weitere 24 Stunden fort. Koloniepicks, die auf BCYE-Agar wachsen, aber nicht auf BCYE (-) Agar, sind mutmaßlich Legionellen Spezies und müssen weiter auf eindeutige Identifizierung unter Verwendung des direkt fluoreszierenden Antikörpers (DFA) oder des Objektträgeragglutinationstests (SAT) untersucht werden.
  5. Schon seit Legionellen ist ein relativ langsam wachsendes Bakterium, negative Platten sollten bis 7 Tage nach der Inokulation erneut inkubiert und dann erneut auf untersucht werden Legionellen Kolonien. Teller nach dem siebten Tag wegwerfen.

Wärmeanreicherung

Wärmeanreicherung (oder „Kokultur“) von Proben, die negativ sind für Legionellen nach Primärkultur kann die Erholung dieses Organismus signifikant verbessern. Dieses Verfahren basiert auf der Feststellung, dass viele Wasserproben Protozoen enthalten, die als Wirt für die intrazelluläre Vermehrung von Legionellen dienen können. Durch Inkubation der Proben bei 35 ° C können sich die Legionellen in diesen Protozoen vermehren und eine kultivierbare Konzentration erreichen. Ergebnisse mehrerer epidemischer Untersuchungen zeigen, dass die anschließende Replikation von Proben zur Isolierung von führt Legionellen spp. von ungefähr 30% aller Proben, die bei der primären Isolierung negativ waren. 25-Milliliter-Aliquots der Proben werden bei 35 ° C in 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit Kunststoffschraubverschluss inkubiert. Bei Tupferproben wird die gesamte Tupferprobe inkubiert. Die Röhrchenkappen sollten festgezogen werden, um die Verdunstung der zugehörigen 3-5 ml Wasserprobe zu minimieren. Inkubierte Proben werden in Intervallen von 2 Wochen bis zu 6 Wochen kultiviert. Die Proben werden auf dem gleichen Plattenschema wie bei der Primärisolierung ausplattiert. Wenn ein Überwachsen des Mediums auftritt, können die Proben wie zuvor beschrieben säurebehandelt werden.

Anhang 1

Vorbereitung der Medien

Gepufferter Agar-Extrakt aus Holzkohlehefe (BCYE)

Eine Zusammensetzung

Eine Zusammensetzung
Norit SG Holzkohle 2,0 g
Hefeextrakt 10,0 g
ACES-Puffer 10,0 g
Eisenpyrophosphat (löslich) 0,25 g
L-Cystein HCl-H20 0,40 g
Agar, Bacto (Oxoid) 17,0 g
Kalium-Alpha-Ketoglutarat 1,0 g
Destilliertes Wasser 1.000 ml

Antibiodische Komponenten für Medien

  1. GPCV-Medium GPCV-Medium
    Glycin 0.3%
    Polymyxin B. 100 Einheiten / ml
    Vancomycin 5 ug / ml
    Cycloheximid 80 ug / ml
  2. PCV-Medium - GPCV-Medium ohne Glycin

ABCYE-Medium

ABCYE-Medium
Rinderserumalbumin (Fraktion V) 10 g / l

Die dehydrierte BCYE-Agar-Basis ist aus verschiedenen kommerziellen Quellen erhältlich.

B. Anweisungen

  1. Fügen Sie ACES-Puffer zu 940 ml destilliertem Wasser hinzu und lösen Sie es in einem 50 ° C Wasserbad.
  2. Fügen Sie der Pufferlösung ausreichend 1,0 N KOH (ca. 40 ml) hinzu, um den pH-Wert auf 6,9 zu bringen, und mischen Sie. (Verwenden Sie kein NaOH, da es sich als hemmend erwiesen hat Legionella pneumophila).
  3. In einen zweiten Kolben Holzkohle, Hefeextrakt, Alpha-Keto-Glutarat und Agar geben. Mischen Sie die trockenen Pulver.
  4. Gießen Sie die Pufferlösung in den zweiten Kolben mit den trockenen Pulvern und mischen Sie.
  5. Zum Auflösen des Agars vorsichtig erhitzen und dann durch 15-minütiges Autoklavieren bei 121 ° C sterilisieren.
  6. Stellen Sie das Medium sofort in ein Wasserbad mit 50 ° C.
  7. Für ein vollständiges Medium wird eine membranfiltrierte Lösung von L-Cystein zum Medium gegeben und gründlich gemischt.
  8. Fügen Sie membranfiltriertes lösliches Eisenpyrophosphat hinzu und mischen Sie es gründlich. Mischen Sie Eisen und Cystein nicht, bevor Sie es dem Medium hinzufügen.
  9. Stellen Sie den pH-Wert des Mediums bei Raumtemperatur auf 6,9 ein. Da die Reagenzien variieren können, muss jedes Labor die erforderliche Menge an KOH bestimmen. Halten Sie das fertige Medium bei 50 ° C, gießen Sie eine 10-ml-Probe ein und überprüfen Sie den pH-Wert bei Raumtemperatur. Stellen Sie das fertige Medium bei Bedarf entweder mit 1,0 N KOH oder 1,0 HCl ein. Beachten Sie, dass der pKa des ACES-Puffers 6,9 bei 20 ° C und 6,8 ​​bei 25 ° C beträgt. Sein pKa wird von der Temperatur beeinflusst (0,02 pH-Einheit / o). Sobald sich der Agar verfestigt hat, scheint sich der pH-Wert nicht mit der Temperatur zu ändern, sondern bleibt bei 6,9.
  10. Zur Herstellung von BCYE + -Antikiodika membrangefilterte Antibiodika hinzufügen und mischen.
  11. Bei BCYE + Albumin-Agar das Albumin in destilliertem Wasser lösen und vor der Zugabe zum Medium filtersterilisieren.
  12. 20 ml pro 15 x 100 mm Petrischale abgeben.

Das Medium muss während des Gießens häufig gemischt werden, um die Holzkohlepartikel suspendiert zu halten. Nachdem sich das Medium verfestigt hat, sollten die Platten im Dunkeln in Plastiktüten im Kühlschrank aufbewahrt werden. Sie sollten ungefähr 4 Monate haltbar sein, vorausgesetzt, sie bestehen die Qualitätskontrolle.

C. Vorsichtsmaßnahmen

  1. Das lösliche Eisenpyrophosphat muss trocken und im Dunkeln gehalten werden.
  2. Jedes Mal müssen frische Lösungen von L-Cystein und Eisenpyrophosphat hergestellt werden. Da L-Cystein ein Chelatbildner ist, muss es zuerst dem Medium zugesetzt werden. Beide Lösungen müssen langsam zugegeben werden. Dies gilt auch für die Zugabe von 1,0 N KOH.
  3. Verwenden Sie kein Eisenpyrophosphat, wenn seine grüne Farbe gelb oder braun wird.

Qualitätskontrolle von Medien

Jede Mediumcharge sollte auf den pH-Wert und die Fähigkeit getestet werden, das Wachstum von zu unterstützen L. pneumophila. Idealerweise sollten alle Medien mit einem standardisierten Gewebeinokulum getestet werden. Da dieses Material jedoch nicht allgemein verfügbar ist, wird ein Stammkultur-Inokulum empfohlen.

  1. Der pH-Wert des Mediums muss 6,90 +/- 0,05 betragen. Mit einem pH-Meter messen. Verwenden Sie zur Überprüfung fester Medien eine Oberflächenelektrode (falls verfügbar) oder emulgieren Sie den Agar von einer Platte in destilliertem Wasser und messen Sie den pH-Wert der Emulsion. Der pH ist kritisch. Wenn gegebene Mengen von Inhaltsstoffen nicht dem akzeptablen pH-Bereich entsprechen, stellen Sie den pH-Wert des fertigen flüssigen Mediums durch Zugabe von 1,0 N KOH oder 1,0 N HCl ein.
  2. Überprüfen Sie das Wachstum folgendermaßen:
    1. Bereiten Sie ein Standard-Stammkultur-Inokulum durch Suspendieren vor L. pneumophila (logarithmische Phase) in sterilem destilliertem Wasser bis zu einer Konzentration von 10º Zellen / ml.
    2. Inokulieren Sie das Medium mit 0,05 ml des Standard-Inokulums. Streifen Sie die Platten, um isolierte Kolonien zu erhalten, und inkubieren Sie bei 35 ° C in Luft plus 2,5% CO2.
    3. Untersuchen Sie die Medien täglich. Auf Agarplatten sollte nach einem Tag Wachstum im stark inokulierten Bereich vorhanden sein. Isolierte Kolonien sollten in 2 bis 3 Tagen makroskopisch sichtbar sein. Wenn Zellen im Standard-Inokulum gekühlt oder gefroren wurden, ist das Wachstum langsamer.
  3. Wenn möglich, sollten selektive Medien mit einer Umweltwasserprobe überprüft werden, die eine bekannte Konzentration an Legionellen und anderen Bakterien enthält.

Anlage 2

Reagenzien für das Säurebehandlungsverfahren

KCl-HCl-Säure

  1. 0,2 M KCl (14,9 g / l in destilliertem Wasser)
  2. 0,2 M HCl (16,7 g / l in destilliertem Wasser)
    1. Mischen Sie 18 Teile von (A) mit 1 Teil von (B)
    2. In 1,0 ml-Volumina in Röhrchen mit Schraubverschluss geben und durch Autoklavieren sterilisieren

Verweise

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